质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定实验报告

 时间:2018-06-27 18:19:26 贡献者:边缘的流年

导读:质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法;2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法;3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法

质粒dna的提取,定量,酶切与pcr鉴定ppt
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质粒 DNA 的提取、定量、酶切与 PCR 鉴定 一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒 DNA 的方法; 2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法; 3.学习并掌握紫外吸收检测 DNA 浓度和纯度的原理和方法; 4.学习并掌握 PCR 基因扩增的实验原理和操作方法; 5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。

二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反应) 在 DNA 聚合酶催化下, 可以 DNA 为模板, 以特定引物为延伸起点, 以 dNTP 为原料, 通过变性、退火、延伸等步骤, 在体外(缓冲液中)复制 DNA,使目的 DNA 按 2n 方 式呈指数形式扩增。

PCR 一次循环的具体反应步骤为: A.变性:加热反应系统至 95℃,使模板 DNA 在高温下完全变性,双链解链 。

B.退火:逐渐降低溶液温度,使合成引物在低温(35-70℃,一般低于模板 Tm 值的 5℃ 左右),与模板 DNA 互补退火形成部分双链。

C.延伸:溶液反应温度升至中温 72℃,在 Taq 酶作用下,以 dNTP 为原料,引物为复 制起点,模板 DNA 的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。

2.质粒 DNA 的提取与制备 (1).碱裂解法: 染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性存在差异: A.高碱性条件下,染色体 DNA 和质粒 DNA 均变性;

B.当以高盐缓冲液调节其 pH 值至中性时,变性的质粒 DNA 复性并保存在溶液中,染 色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构,可通过离心形成沉沉淀去除。

(2).离心层析柱: A.硅基质膜在高盐、低 pH 值状态下可选择性地结合溶液中的质粒 DNA,而不吸附溶液 中的蛋白质和多糖等物质; B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除; C.低盐,高 pH 值的洗脱缓冲液将纯净质粒 DNA 从硅基质膜上洗脱。

3.质粒 DNA 的定量分析(紫外分光光度法): A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应,且其对光的吸收是具有选择性; B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱: DNA 分对波长 260nm 的紫外光有特异的吸收峰 蛋白质对波长 280nm 的紫外光有特异的吸收峰 碳水化合物对 230nm 的紫外光有特异的吸收峰 C.A260/A280 及 A260/A230 的比值可以反应 DNA 的纯度; A260/A280=1.8 A260/A280<1.8 A260/A280>1.8 DNA 纯净表示样品中含蛋白质(芳香族)或酚类物质含 RNA 杂质,用 RNA 酶去除。

4.质粒 DNA 的酶切鉴定: 限制性内切酶是 DNA 重组操作过程中所使用的基本工具。

限制性内切酶能特异性地与 一段被称为限制酶识别序列的特殊 DNA 序列结合,或是与其附近的特异位点结合,并 在结合位点切割双链 DNA。

5.琼脂糖凝胶电泳: 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的大小决定于 琼脂糖的浓度。

DNA 分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。

DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应:不同的 DNA,分子量大小 及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数 值成反比关系).三、材料与方法: (一)实验材料:1.PCR 仪器:PCR 仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管 材料:菌液【大肠杆菌 DH5a 菌株(pMD19-T 质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白 GFP)】、 无菌去离子水、2×Premix Taq、引物 2. 质粒 DNA 的提取与制备 仪器:恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf 管、微量加样枪、离心管 材料:溶液 P1(S1)、溶液 P2 (S2)、溶液 P3(S3)、去蛋白液 PE(W1)漂洗液 WB(W2)、洗脱液 EB(Eluent)、含 pMD19-T 质粒的大肠杆菌 DH5α 3. 质粒 DNA 的定量(紫外分光光度法) 仪器:比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪 材料:蒸馏水、质粒DNA 4.质粒 DNA 的酶切鉴定 仪器:1.5ml 的 EP 管、微量加样枪 材料:无菌水、10× M 酶切缓冲液 Buf R、质粒 DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul) 5.琼脂糖凝胶电泳

仪器:凝胶电泳系统、凝胶成像系统 材料:电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液(二)实验方法 1.PCR准备目的 DNA:菌液煮沸 10min,冷冻,室温解冻后离心取上清液取 0.2 ml PCR 反应管一只,用微量加样枪按下述顺序分别加入:灭菌去离子水 5.5μl、2*Premix Taq12.5μl、引物 1 (10 mol/L) 1μl、引物 2 (10 mol/L) 1μl、菌液 5μl将 PCR 反应管置台式离心机中瞬时离心将装有 PCR 反应体系的 PCR 反应管放入 PCR 仪上进行如下操作: ①94℃预变性 5 分钟后开始以下循环 ②循环为 94℃——30 秒, 50℃——30 秒, 72℃ ——1 分钟。

循环为 30 次 ③72℃ 5 分钟 ④4 ℃ 保温将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中2. 质粒 DNA 的提取与制备取 1.5ml 培养物加入 Eppendorf 管中13000rpm x 1min,弃上清

加入 250μ l 溶液 S1,吹打,使细菌沉淀分散,彻底悬浮加入 250μl 溶液 S2,颠倒 4~6 次混匀(不要剧烈振荡),直到溶液变得清亮加入 350μl 溶液 S3,立即温和混匀 6~8 次。

13000rpm 离心 10min,小心取上清液(500-800μl )将吸附柱放于收集管中,将上一步所得上清液加入吸附柱中,13000rpm 离心 3min,弃滤液加入 500μl 去蛋白液(W1),13000rpm 离心 1min,弃滤液向吸附柱中加入 700μl 漂洗液 W2, 13000rpm 离心 1min ,弃滤液;重复一遍 操作 空柱 13000rpm 离心 1min,然后室温放置 3min,使残留乙醇挥发取出吸附柱,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间加 50μl 洗脱缓冲液 (Eluent),室温放置 1min,13000rpm 离心 1min 洗脱质粒 DNA, -20℃保存备用3. 质粒 DNA 的定量(紫外分光光度法)清洗比色皿:用微量加样枪向比色皿加入适 量的蒸馏水刷洗,2~3 次。

并用滤纸擦拭干净空白对照比色测定 向比色皿加入 98ul 蒸馏水, 进行 Blank 调零再向比色皿加入 2ul 的质粒 DNA,于紫外分光 光度计上进行‘sample’测定,记录相关数据

4.质粒 DNA 的酶切鉴定 在一个洁净的 1.5mlEP 管中按顺序依次加入下述试剂 无菌水 9.0μl、10× M 酶切缓冲液 2.0μl、 质粒 DNA 7.0μl、 Hind III (15U/ul) 1.0μl、 EcoR I (12U/ul) 1.0μl小心混匀试剂,将 EP 管置于恒温水浴箱中 37℃1.5 小时。

5.琼脂糖凝胶电泳 取质粒 DNA、 经酶切反应后的 DNA 片段和 PCR 扩增的 DNA 各 6μ l 于三个 EP 管中并做好标记往每个 EP 管中加入 1μ lGelview 染料,室温放置一分钟用微量加样枪分别各吸取 10ul, 按序号加入到电泳仪的凝胶孔中电泳 30 分钟取出凝胶紫外光下观察,拍照四、结果与讨论:(一)实验现象 1.加入溶液 P1,出现悬浮现象; 2.加入溶液 P2,温和混匀,溶液会变得清亮;

3.加入溶液 P3,有白色絮状沉淀生成; 4.电泳时,可观察到在电流作用下,点样的溶液出现电泳现象,电泳速度不同。

在紫外检测仪条件下,可以观察到不同的物质出现不同的电泳带。

(二)实验结果 原始实验数据 测量次数 1 2 3 平均值 质粒 DNA 浓度(ug/ml) 148 106 115 123 Ratio 比值(A260/A280) 1.46 1.52 1.45 1.47电泳后的图片A:PCR 目的条带 B:酶切片段 C:质粒 DNA(四)实验分析 1.由上数据可知,Ratio=1.47 A260/A280<1.8 表明样品中含有较多的蛋白质(芳香族)

2. 在 图 片 中 , 其 他 三 类 DNA 与 Maker 相 比 较 , 可 知 质 粒 DNA 的 分 子 大 小 在 2500bp-3500bp,酶切反应的质粒 DNA 片段分子大小在 2800-3000bp 和 400-500 左右, PCR 的 DNA 分子大小在 400-500bp。

基本符合预期。

(四)实验讨论 1.质粒 DNA 中出现三条带,分别对应超螺旋质粒 DNA、线性 DNA 和开环状质粒 DNA。

这 三种不同构型的分子有不同的迁移率,在一般情况下,迁移速度最快的为超螺旋型,其 次为线性分子,最慢的为开环状分子,所以条带从上到下分别为:超螺旋型 DNA、线性 分子、开环状分子。

, 2.对于实验结果中:A260/A280<1.8 的可能原因为: A.在质粒 DNA 的提取实验的“取上清液”步骤中吸入沉淀导致引入较多的蛋白杂质,进 而导致后续实验中因蛋白质量较多而难以去除。

B.可能为试剂污染引起杂质蛋白的引入。

3.实验中需注意的事项: 用微量加样枪加试剂时,同种试剂可以不用换吸头,每次换不同试剂时要记得换一个新 吸头。

在 PCR 中,如果配好的反应液较多沾到管壁上,要将 PCR 反应管置台式离心机中瞬时离 心,使反应液集中于管底,然后才将反应管放到基因扩增仪上。

在质粒 DNA 提取的实验中,加入溶液 S2 时,时间不能太久,动作要温柔,轻轻颠倒几 次。

在电泳实验中,点样时枪头下伸,点样孔内不能有气泡。

在电泳中,Geldview 有毒,切勿用手接触。

思考题: (1)碱裂解法提取质粒时,溶液 I、II、III 的作用分别为? 答:

溶液 I:螯合金属离子,抑制脱氧核酸酶对 DNA 的降解作用;有利于溶酶体的作用。

溶液 II:细胞壁肽聚糖在碱性下水解,核酸和蛋白质变性。

溶液 III:酸性条件下质粒 DNA 复性,变性蛋白-SDS+线性 DNA 沉淀,Na+可中和 DNA。

(2)结合实验情况,如何提高限制性酶切的反应效率? 答: ①尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。

②酶量的选择任何时候 2 种酶的总量不能超过反应体系的 1/10 体积,而且最大反应体 系最好不要小于 20 ul,且酶切反应中甘油浓度应低于 5%。

③底物 DNA 的纯度:主要污染 DNA 的某些物质,如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反应应 尽量纯化底物。

④反应系统: 主要是反应缓冲液中的离子强度,如 NaCl 和 Mg2+, 合适离子强度可以激发 酶切反应。

 
 

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